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探针和引物的选择要保守，一般选择一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。
在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。
Real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。探针的第一位一般不用G碱基。
详细的算法清查阅相关书籍。我用ABI的Primer Express设计探针，很好用。