siRNA设计与技术服务

siRNA设计

    siRNA序列的结构对RNAi实验的成功与否起着至关重要的作用。不同的siRNA序列，对基因的沉默效率差异很大。因此，理性设计有效的siRNA就成为实验成功的关键因素之一。

    本公司推荐考虑如下设计思想：
    　从起始密码子下游50 - 100个nt开始，避免5’端或3’端的UTRs，搜索AA (N19) 序列。因为这些区域结合了大量的调控蛋白，可能会影响siRNA发挥作用。
    　分析siRNA两端能量分布
    　N19序列3’端垂悬两个dTdT，该垂悬不与mRNA序列互补，使有义链3’端更容易解链，从而增加其沉默效率。
       21个碱基的siRNA单链序列如：5’-GGCCAGAGGUUGAAAGUGAdTdT-3’
    　对mRNA目标区域进行二级结构预测，排除作用复杂的二级结构的siRNA序列。因为二级结构越复杂，siRNA沉默效率越低。
          下图表明设计的siRNA结构优势依次递增 a) < b) < c)
 

    　在NCBI数据库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中进行Blast对照，排除设计的序列和其他基因的同源性，降低脱靶效应。
    　避免出现连续的多个G或C，GC含量最好在30 – 55 %之间。
    　设计中，对siRNA两端的错配可以高度容忍，但中间的5 - 11位碱基的错配，对沉默效应会有较大影响。

    本公司专业技术人员免费帮您针对同一个基因设计3 - 4对siRNA，您只需提供基因的Accession Number、mRNA序列或者Gene ID等信息即可，设计好后交您确认，如果抑制效率达不到70 % (转染效率至少90 %)，我们免费重新设计和合成。

普通siRNA oligo

　　普通的 siRNA oligo 根据客户要求，采用脱盐、PAGE或HPLC纯化的方法，有效去除短、杂片段。客户只需用无RNA酶水稀释后即可使用。

修饰和标记的siRNA oligo

　　可对siRNA进行多种标记物的标记，包括FAM、Cy3、Cy5、胆固醇(cholesterol)、Biotin。相对于未标记的siRNA具有转染情况可视的优点，通过流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等可以观察到荧光标记的siRNA，方便优化转染条件、siRNA胞内定位等，同时可根据对转染过程的全程追踪来分析转染和蛋白表达的关系。研究表明，反义链5’端标记会影响干扰效果，其他三个末端修饰后对沉默活性几乎没影响，目前公认最好的是将荧光修饰标记在正义链的5’端位点。5’-荧光标记的siRNA有助于直接观察转染效率。本公司提供的5’-荧光标记的siRNA通常用FAM进行标记。